在防晒保护评估方面，漫反射光谱技术最初仅限于测量紫外线（UVA）范围内的防护效果。然而，近年来开发了一种名为“混合漫反射光谱技术（Hybrid Diffuse Reflectance Spectroscopy, HDRS）”的新技术，能够全面评估整个太阳紫外光谱（290-400nm）范围内的紫外线（UV）防护效果。

HDRS技术提供了一种快速、简便的体内防晒保护评估方法，可能取代目前全球监管机构要求的对人类受试者进行广泛晒伤和损伤性测试。本指南详细介绍了HDRS的背景、理论基础及其测量方法，旨在为防晒产品保护效果的科学评估提供技术支持。

1）如何评估外用防晒霜的保护效果？

传统上，防晒保护效果的评估主要依赖于对人类受试者进行紫外线（UV）辐射暴露实验，直至其皮肤出现可见的晒伤（红斑反应，erythema）。最初的测试是在户外进行的，使用大自然的阳光作为光源，并通过测量紫外线暴露剂量来确定未涂抹防晒霜的皮肤与涂抹防晒霜的皮肤所需的暴露量之比。这一比值最初被称为“P”或“保护因子”，后来发展为“防晒指数（Sun Protection Factor, SPF）”。

然而，户外测试防晒效果存在诸多困难，主要原因是天气条件的不可预测性，以及紫外线光谱分布和强度随时间、季节和大气条件的变化。为解决这些问题，Dr. Blum首次在实验室中使用多种紫外线光源进行防晒测试。他在观察大量测试结果后指出：“即使在受控的实验室条件下评估防晒产品的保护效果，仍存在诸多困难，难以达到高度精确性。即便采用最精密的实验室测量方法，也难以全面评估某一防晒产品对特定阳光暴露条件的适用性。这些因素使得某些防晒产品的宣传声明虽然并非完全虚假，但可能对消费者造成误导。”

通过这些历史背景和方法的回顾，我们可以更好地理解当前防晒保护评估技术的发展与改进。

2）实验室防晒指数（SPF）测试的太阳模拟器

太阳紫外线（UV）模拟器和紫外线传感器辐射计的发明，使得在实验室中进行可重复的防晒霜SPF测试成为可能。这一技术由Solar Light公司（更多消息：Solar Light金标准SPF测试：HDRS技术如何定义防晒新标杆？）的创始人Daniel Berger开发。1978年，美国食品药品监督管理局（FDA）首次颁布了使用这些设备测量防晒霜SPF的标准化程序。

Berger后来设计了一种名为Multiport®的太阳模拟器，该设备具有6个输出光束，已成为全球测试高SPF防晒霜的标准设备。这种模拟器能够同时进行多个测试，大幅提高实验室的测试效率，并符合最新的国际标准，包括FDA、ISO、JCIA和COLIPA。

通过这些技术的不断发展，太阳模拟器在防晒产品的研发和测试中发挥了重要作用，为消费者提供了更安全、更有效的防晒保护。

3）替代方法

目前，使用模拟阳光进行高剂量晒伤测试以评估防晒霜保护效果的方法已被全球采纳为产品防晒指数（SPF）标识的“金标准”。（更多消息：Solar Light金标准SPF测试：HDRS技术如何定义防晒新标杆？）然而，确定SPF值的程序复杂、耗时且对受试者有害。几十年来，防晒产品制造商一直在努力开发预测性的体外测试方法，以指导配方开发并验证最终产品的功效声明。

传统的稀释溶液光谱法由于未考虑在人体皮肤上形成均匀薄膜等关键因素，对防晒效果的估计往往过高。使用各种基板的薄膜光谱法也被证明不可靠，主要原因是人工操作涂抹的差异，以及防晒配方成分与众多测试基板表面之间的相互作用不可预测。用机器人替代人工操作以实现涂抹的一致性，提高了测试的重复性，但体外光谱SPF预测与体内测试结果之间的差异仍然较大，目前仅限于乳液类产品，且尚未对塑料板基板上的防水性能进行验证。

1）UVA-PF测试方法的开发

由马萨诸塞州总医院的Nikoforos Kollias博士和Robert Gilles博士发起的研究，首次将漫反射光谱（DRS）设备应用于防晒产品功效测试。Kollias博士的DRS设备最初被用作皮肤光谱荧光仪，用于评估皮肤特性，如增殖状态、胶原蛋白和弹性蛋白的交联程度、皮肤癌以及其他由紫外线引起的皮肤现象。

漫反射光谱荧光法涉及使用特定波长的光激发皮肤中的生色团，同时在另一（更长）波长监测荧光。这通常通过扫描一系列激发波长并在固定波长测量，或在已知激发波长的情况下扫描一系列（更长）波长来确定荧光范围。

图1.光纤探头演示扩散原理在有/没有防晒剂施加到皮肤上的情况下的反射光谱

在1990年代末和2000年代初，进行了大量研究以建立可靠的UVA范围防晒保护评估方法，包括体外和体内测试。L'Oréal的研究人员与Kollias博士和Gilles博士合作，将漫反射光谱荧光设备应用于评估涂抹在皮肤上的防晒产品的吸收特性。这通过同步两个单色仪并比较皮肤反射的信号来实现，首先是在未涂抹防晒产品的情况下，然后是在涂抹防晒产品的情况下。该波长下防晒产品的表观透射率是信号比的平方根（公式1a）。该技术被用于评估涂抹在人类皮肤上并暴露于紫外线下防晒产品的光稳定性。

进一步的研究工作旨在将通过DRS UVA吸收光谱计算的绝对UVA防护因子（UVA-PF）与防晒产品的体内评估相关联。2012年发布的ISO24443体外测试方法为确定防晒产品的UVA防护效果提供了满足行业需求的解决方案，以满足广谱保护声明的要求。然而，ISO24443 UVA-PF方法仍需要输入已知的体内SPF值。

随着测试需求的增加和对受试者安全性的关注，开发一种非侵入性（非晒伤性）的替代方法来确定防晒产品的SPF值变得日益迫切。

2）单色光漫反射光谱技术

体外薄膜光谱技术在提供涂覆于聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）板上的防晒产品的全光谱吸收扫描形状方面已被证明具有重要价值。然而，由于操作人员涂抹方式的差异以及不同防晒配方与PMMA板表面相互作用对薄膜完整性和一致性的影响，确定这些扫描的绝对吸收尺度被证明是一项具有挑战性的任务。

使用人体皮肤作为防晒产品的基板可以克服这一局限性。然而，漫反射光谱（DRS）在评估皮肤上防晒产品吸收时仍存在一个主要局限性，即其在UVB范围内测量反射光的能力受限，因为皮肤在约320nm以下波长的反射能量较低。蛋白质、DNA和黑色素对UVB辐射的吸收非常强，因此很少有入射UVB光子从皮肤反射出来用于测量。此外，在DRS测量中，光需要穿过防晒层，这使得吸收加倍，进一步复杂化了测量过程。因此，皮肤表面防晒产品的光谱分析主要限于UVA范围（320-400nm）。（更多消息：防晒到底在防什么？如何防？）

图2.使用单色DRS设备测量的皮肤表观吸光度。

Ruvolo、Kollias和Cole开发了一种方法，通过将防晒产品在体外吸收扫描中获得的吸收值与漫反射光谱（DRS）设备测量的防晒光谱吸收值相结合，将UVB吸收值的形状整合到防晒产品的吸收光谱中。这种方法实现了防晒产品在人体皮肤上的吸收特性评估，形成了一种“混合”体内-体外评估方法，从而克服了UVB范围测量的局限性。

图3.A）表示PMMA板上290- 400 nm防晒剂吸光度的体外扫描，显示了整个范围内的正确光谱形状；B）示出了具有正确形状和绝对振幅的光谱，如通过DRS在UVA光谱320- 400 nm上测量；C）在该实施案例中，通过将体外光谱的每个波长乘以因子0.72/0.38，在345 nm处对光谱进行归一化，然后将体外测量的UVB部分移植或“修补”到DRS光谱的末端，以提供DRS光谱的缺失部分；D）显示了完整的混合光谱，可用于计算SPF、UVA-PF、临界波长（CW）和UVA 1/UV比。在混合扩散之间表现出良好的相关性和反射率测量和体内SPF测量。

图4. 单色光漫反射光谱技术通过以下步骤评估防晒产品在人体皮肤上的功效：首先，在未涂抹防晒产品的皮肤上进行DRS测量，然后在涂抹防晒产品的皮肤上再次进行测量。防晒产品的吸收值通过计算两次测量值的平方根比值来确定，该比值与波长（320-400nm）相关。接下来，按照ISO24443标准对防晒产品进行体外全光谱扫描，将扫描结果缩放到与DRS光谱在UVA范围内的部分相匹配。最后，将UVB部分的光谱数据整合到DRS光谱中，形成覆盖290-400nm范围的绝对值全光谱扫描。这种方法结合了体内和体外测试的优势，为防晒产品的全面评估提供了可靠的技术支持。

为了准确评估在紫外线照射下会发生降解的防晒产品，必须对阳光暴露期间防护能力的损失进行补偿。采用ISO24443标准中的紫外线照射挑战程序，通过比较体外PMMA板测量的照射前后的光谱，确定每种特定防晒产品的光降解程度，并在每个特定波长对未照射的DRS光谱进行调整，以反映因光降解导致的吸收损失（光降解标量比SRPD(λ)）。最终，将调整后的DRS光谱与体外UVB光谱结合，形成完整的混合光谱。

Rohr等人对80种不同形式（乳液、喷雾、棒状、凝胶）的防晒产品以及高达SPF 100以上的紫外线过滤组合进行了评估，结果显示HDRS测量值与体内SPF测试结果具有高度相关性。这些数据表明，光稳定性对最终SPF值有显著影响，通过使用上述SRPD(λ)校正，相关系数r²从0.483提高到0.973。此外，相关性的斜率从1.27（SPF高估）调整为1.05，反映了光降解校正的重要性。 

使用单色光DRS协议的测量方法使皮肤暴露于极低剂量的紫外线辐射下，且无需接触UVB波长。Solar Light单色光DRS设备在任何波长的强度约为0.3 mW/cm²，总累积UVA剂量为0.1 mJ/cm²，不到标准红斑剂量（SED）的0.05%。这相当于在夏季中午户外阳光下不到1秒的暴露量。

防晒产品的光降解挑战在体外PMMA板上进行，无需在人体皮肤上进行测试。DRS光谱技术解决了防晒产品与基板相互作用的问题，因为基板是实际的人体皮肤。因此，所有类型的防晒形式（乳液、棒状、粉末、喷雾产品）在测试中的相互作用与消费者实际使用时相同。 

DRS方法的另一个优势是，测试还可以在模拟水浸泡、出汗、沙子和毛巾摩擦等条件下的人体皮肤上进行。例如，有研究评估了在剧烈运动和出汗后防晒样本在皮肤上的持久性。

4）多色光漫反射光谱（DRS）

在为Solar Light设计紧凑型单色光DRS设备的计划中，Solar Light的顾问Curtis Cole博士意识到，混合漫反射光谱（HDRS）评估防晒产品的过程可以进一步简化，甚至无需使用一个或两个单色仪。通过采用与体内UVA-PF临床协议中使用的UVA光源光谱相同的光源，以及与皮肤的持续性色素暗沉（PPD）作用光谱相似的探测器系统，可以直接测量UVA-PF值，而无需使用光分散元件。 这种UVA-PF的估算值可以用于缩放体外全光谱吸收扫描，从而计算出防晒指数（SPF）、临界波长及其他评估参数。 Cole博士与Solar Light的科学家和工程师合作，开发并测试了一种原型设备，并使用一系列防晒样本进行了验证。这种方法不仅简化了传统DRS技术的复杂性，还为防晒产品的全面评估提供了高效、精准的解决方案。

图5. 多色光漫反射光谱（DRS）系统示意图，用于直接测量人体皮肤上防晒产品的UVA-PF值。通过该系统测得的UVA-PF值，可用于缩放防晒产品的体外全光谱吸收扫描，进而计算出防晒指数（SPF）、临界波长（CW）等参数。研究显示，通过DRS测定的SPF和UVA-PF值与体内测试结果具有非常强的相关性，其回归斜率接近1，表明两者之间存在一一对应关系。

图6.展示了通过PHDRS设备测定的SPF和UVA-PF值与通过体内测试（ISO24443标准）获得的SPF和UVA-PF值之间的相关性对比。

与单色光DRS方法相比，多色光DRS方法具有以下优势： 

设备设计简化：多色光方法消除了对发射和检测单色仪及相关软件的需求，简化了设备设计和结构。 

数据采集时间显著缩短：单个测试点的评估仅需通过光纤探头触碰测试点2-3秒即可完成，而单色光扫描单个测试点通常需要30-120秒。这使得在相同（或更短）的时间内可以进行更多的测量。 

技术实现：多色光方法利用体外扫描形状，并通过多色光UVA-PF值进行缩放，替代了传统的DRS UVA吸收光谱。 

光降解补偿计算：在光降解补偿方面，多色光方法的计算过程与单色光HDRS方法几乎相同，确保了测试结果的准确性和一致性。 这种方法不仅提高了测试效率，还降低了设备复杂性，为防晒产品的评估提供了更便捷的解决方案。

随着单色光和多色光设备在评估防晒产品功效方面的初步成功，以及寻找替代侵入性体内人体临床测试方法的紧迫性日益增加，混合漫反射光谱（HDRS）（更多消息：HDRS – 混合漫反射光谱法：非红斑体内驱动 SPF 和 UVA-PF 测试）技术被提议开发为ISO标准方法。为了有资格被考虑为ISO方法，在接受为新工作项目之前，需要多中心试验的数据来提供充分的信心以确保其成功。

多实验室研究的HDRS测试方法

为评估25种防晒样本，组织了一项涉及4个实验室的环形测试。测试样本包括23种乳液产品和2种喷雾产品，涵盖了多种粘度和紫外线过滤剂及其组合，包括仅有机紫外线过滤剂、仅无机过滤剂及其组合。SPF值范围为7至66，UVA-PF值范围为1.2至28。测试中使用了3台单色光DRS设备和1台多色光DRS设备，临床测试地点分布在欧洲、南美洲和北美洲。

测试结果显示，四个实验室之间的结果具有一致性，单色光DRS和多色光DRS数据之间也表现出良好的一致性。这些结果为HDRS技术作为ISO标准方法的进一步发展提供了有力支持。

图7.将三种单色DRS装置的25个测试样本的SPF和UVA-PF结果与体内SPF以及体内和体外UVA-PF（ISO 24443）结果进行比较

图8.多色DRS设备对25个测试样本的SPF和UVA-PF结果与体内和体外UVA-PF（ISO 24443）结果进行比较。

图9. SPF（A）和UVA-PF（ISO24443）（B）的Passing-Bablok回归图，汇总了4个实验室的结果。图中的蓝色带表示回归的95%置信区间。需要注意的是，数据以自然对数（ln）转换的形式呈现，因为数据呈对数正态分布。这种展示方式有助于更清晰地比较不同实验室之间的结果一致性。

虽然回归分析可以提供两种测量方法（HDRS和体内结果）之间相似性的良好印象，但已被证明在确认两种测量方法的等效性方面并不理想。回归分析和依赖相关系数来指示两种测量方法之间关系的优劣，可能会受到某些具有长力臂数据值的严重影响。 Bland和Altman开发了一种分析方法，该方法评估两种测量方法在整个数值范围内的协议限度，而不会对较高值给予更重的权重，并评估两种测量方法之间的整体偏差。这种方法已成为生物医学领域证明两种独立测量方法生物等效性的首选分析方法。 将Bland-Altman分析应用于SPF数据，比较HDRS值与体内测定的SPF值（在自然对数转换域中），可以确定两种测试方法的协议限度。

基于这些成功的结果，HDRS方法在2018年被接受为ISO23698的新工作项目，用于开发为国际标准。（更多消息：2024年12月ISO23698标准正式发布）

图10.通过HDRS方法和体内临床SPF评价确定的SPF数据分析显示，与体内SPF相比，HDRS结果有+4%的轻微偏倚，两种方法之间的一致性，在SPF 7至SPF 66的整个值范围内为-14%至+20%。

HDRS测试方法的现状

截至2022年，混合漫反射光谱（HDRS）测试方法已被Cosmetics Europe（CE）推荐作为ISO24444的替代方法。CE指出：“考虑到正确使用这两种方法（体外‘双板’方法和HDRS方法）需要足够的培训和经验，我们强烈建议CE成员（及其合作的测试实验室）尽快熟悉这些方法，以便在最终ISO标准发布之前，它们可以被视为ISO24444:2019的替代SPF测试方法。然而，在这两种方法作为最终ISO标准发布之前，如果与ISO24444:2019的结果存在差异，后者应继续被视为黄金标准。”

由Alt-SPF联盟2022-2023年进行的一项大规模多中心验证研究正在比较替代方法（包括单色光和多色光HDRS设备）与ISO24444（2019）体内SPF测试。ISOTC217-WG7已编制了一套全面的验收标准，这些标准必须满足才能验证ISO23698（HDRS）。同时，CE建议N0 26已发布这两种方法的详细信息，以便实验室和制造商可以在ISO 23698或ISO 23695验证完成之前开始使用这些替代方法。在这些替代SPF测试方法的结果被当地监管机构接受之前，适用当地法规。测试实验室应获取必要的设备，并在ISO标准最终确定之前熟悉这些替代方法所需的协议和计算，以便将这些方法作为正在进行的体内测试的筛选工具。（更多消息：2024年12月ISO23698标准正式发布）

HDRS在防晒产品的评估中具有优势，因为它适用于所有防晒产品形式，使用真实的人体皮肤，因此可以依赖它来预测市场上数量庞大的产品配方在人体皮肤上的最佳性能。它还可以用于评估产品的防水性、抗汗性或抗沙性，而其他测试基板无法显示这些特性。因此，HDRS方法可以在一个测试协议中评估防晒配方的全面保护性能，包括SPF和UVA-PF。所有这些都可以在几秒钟内完成数据采集，无需对皮肤造成损害的紫外线暴露。与需要受试者多次返回实验室的三天测试协议相比，单个短测试周期即可为给定受试者提供多个产品的测试结果。2024年12月ISO23698标准正式发布,HDRS已取代所有传统的侵入性SPF和UVA-PF临床测试程序。