无论使用哪种方法进行蛋白质定量，第一步都是测量相关蛋白质或标准蛋白质的若干稀释液的吸光度。就直接紫外吸光度法而言，280nm处的吸光度与每个样品的已知浓度的关系，根据比尔定律（也称为比尔-郎伯定律），溶液的吸光度取决于吸收分子的浓度和光穿过样品的路径长度。根据这一关系，我们可以利用已知蛋白质样品生成的标准曲线来确定未知蛋白质样品的浓度。

比尔定律：A（λ）= ε（λ）cl， 

• A（λ）为溶液的吸收度，是波长的函数
• ε（λ）是吸收分子的摩尔吸收系数或消光系数，是波长的函数（L/mol·cm）
• c为溶液浓度（mol/L）
• l是光穿过溶液的路径长度（cm）

使用OCEANHDX-UV-VIS光谱仪、DH-2000-BAL平衡氘钨卤素光源、CUV-UV比色皿支架、两根QP230-2-XSR 极耐晒光纤和OceanView 软件中的Absorbance Wizard 测量吸光率。由于BSA不吸收可见光区域的光，因此只使用氘灯进行测量。将光源限制在发生吸收的区域，可减少测量中的杂散光，从而提高高浓度样品的最大吸收水平。将光谱仪和光源预热60 分钟，以消除光谱仪和光源预热到一致温度时产生的漂移，从而提高测量的稳定性。

测量是在单个石英比色皿中进行的，测量过程中不要从比色皿架上取下比色皿。稀释是直接在比色皿中进行的，方法是取出0.5mL样品，然后换为0.5mL水。水加入比色皿后，使用一次性移液管混合样品。稀释可低至0.02 mg/mL。

使用 Ocean HDX测量的蛋白质吸收光谱如图1所示。Ocean HDX的超低杂散光性能使我们能够测量280nm波长芳香族氨基酸峰近3 AU的吸光度。尽管此处未显示结果，但我们也在肽骨吸收的220nm波长附近测得了高于3 AU的吸光度值。

图1：BSA在水中稀释后的吸光度如比尔定律所预测

根据BSA吸光度数据生成的标准曲线如图2所示。在2.4和2.5 AU之间，观察到数据出现平缓或滚降。这种滚降现象表明测量中存在杂散光。杂散光（在不同程度上存在于所有吸光度测量中）限制了系统可以测量的最大吸光度值。

杂散光是指来自设计光路之外的光，无意中落到检测器的任何部分，从而产生错误读数。检测器并不区分落在检测器特定像素上的波长，它只是测量照射到检测器上的光的强度。因此，如果光线落在检测器某个像素（波长）上，而它不应该落在该像素（波长）上，检测器就会错误地输出该波长的读数。这种杂散光通常来自预定光源，但在光谱仪内发生散射，落在探测器的错误位置上，也可能来自完全不同的光源。杂散光为系统能达到的最大吸光度设定了一个工作极限，并通过限制系统的暗度来降低信噪比。杂散光的常见来源包括光栅的高阶反射、光栅的缺陷、光谱仪的内部反射以及光谱仪外壳的漏光。Ocean HDX 的杂散光最低，最大吸收水平最高。

在图3中，从图中删除了蛋白质浓度的最高数据点，以评价测量的线性范围。从 R2 值的提高可以看出，这条线的拟合效果有所改善，表明这条线的方程拟合效果更好，可以提供更准确的蛋白质浓度值。在 2.5 AU 处仍可观察到一些滚降。需要对 4 至 4.5 AU 之间的浓度进行额外测量，以评估该区域的线性度。

利用此图，可通过最佳拟合线方程计算未知 BSA 或其他蛋白质样品的浓度，其中 y 为未知样品的吸光度值。

图3：BSA标准曲线，显示吸光度测量的大致线性范围。